噬菌體計數與檢測方法

由于抗生素濫用及過(guò)度使用，導緻細菌耐藥形勢日益嚴峻。噬菌體作爲感染細菌的病毒，能(néng)夠特異性的殺滅耐藥細菌，使得噬菌體治療重新進(jìn)入人們的視野。一方面(miàn)，爲了有效評估噬菌體臨床治療的結果、揭示微生物群落的複雜動态，需要精确的方法來計數和檢測噬菌體顆粒；另一方面(miàn)，噬菌體計數也是生産和開(kāi)發(fā)以噬菌體爲基礎的産品、檢測細菌感染和食品生物防治所必需的。根據檢測對(duì)象的不同（感染性噬菌體、全噬菌體顆粒、核酸和蛋白質），本周爲大家簡單介紹一些當前主要使用的噬菌體計數和檢測方法。
01   感染性噬菌體檢測方法
噬菌斑計數被認爲是噬菌體計數的金标準。雙瓊脂覆蓋試驗（DLA）允許在含有兩(liǎng)層瓊脂的受限環境（培養皿）中進(jìn)行局部噬菌體與宿主細菌的接觸。其中，底層爲含有1%-1.5%瓊脂的培養基以支持細菌生長(cháng)，頂層含有相同的培養基，但瓊脂濃度較低（0.4%至0.6%），通常被稱爲軟瓊脂。將(jiāng)頂層與宿主細菌混合後(hòu)倒在底層上，形成(chéng)所謂的草坪，再將(jiāng)含有噬菌體的樣品添加在頂層，幹燥；或者噬菌體和宿主細菌孵育後(hòu)與頂層混合，倒在底層上，然後(hòu)在細菌生長(cháng)的最佳溫度和時(shí)間下培養。如果噬菌體能(néng)夠感染被測細菌，則草坪上會(huì)出現清晰的斑點或斑塊。單個菌斑是最初一個噬菌體裂解一個宿主細菌，然後(hòu)後(hòu)代噬菌體殺死鄰近細菌的結果。噬菌體原種(zhǒng)或樣本中感染性噬菌體的濃度（即滴度）可以通過(guò)在草坪上點樣稀釋的樣本來确定，滴度用菌斑形成(chéng)單位（PFU，類似于菌落形成(chéng)單位）表示（見圖1）。
02   全噬菌體顆粒檢測方法
透射電子顯微鏡（TEM）使用電子束産生的分辨率比傳統光學(xué)顯微鏡高1000倍，提高分辨率（降到0.2 nm）足以觀察到病毒。盡管樣本高度濃縮（10^6個顆粒/毫升）才能(néng)産生可靠的結果，但這(zhè)項技術可以用來量化病毒顆粒。用透射電子顯微鏡進(jìn)行病毒定量在确定病毒形态類型和總數方面(miàn)具有很高的準确性，但是當運行多個樣品時(shí)，該技術耗時(shí)、昂貴，而且不能(néng)用于複雜的樣本。此外，樣品的制備也很繁瑣，而且需要熟練的操作人員來操作複雜的儀器。
另一種(zhǒng)計數整個噬菌體顆粒的技術是流式細胞術。在本項技術中，病毒顆粒被熒光染料标記并被引導通過(guò)毛細管。毛細管的直徑小，迫使顆粒以單線流動，從而可以檢測由每個病毒顆粒引起(qǐ)的光散射。該方法快速且嚴謹，因此得到了廣泛應用。值得注意的是，熒光信号與基因組大小無關，但混合樣本中的不同病毒可以根據他們的熒光和側向(xiàng)散射分布區來區分。
由NanoSight Limited公司開(kāi)發(fā)的一種(zhǒng)基于激光的方法可以實時(shí)可視化，基于激光照明光學(xué)顯微鏡的動态光散射在幾分鍾内便可以計數病毒顆粒。但該技術需要相對(duì)較高的樣品濃度（10^7-10^9 PFU / ml）和清澈的液體，對(duì)于土壤和糞便等複雜的樣本很難獲得符合标準的樣品。
03   噬菌體核酸和蛋白質檢測方法
聚合酶鏈式反應（PCR）是一種(zhǒng)簡單而可靠的方法，它以核酸檢測爲基礎，能(néng)比噬菌斑測定更快地驗證噬菌體的存在。通過(guò)應用随機擴增多态性DNA (RAPD) PCR還(hái)可以在幾小時(shí)内區分出不同的噬菌體譜系，而不需要進(jìn)行全基因組測序。然而，由于噬菌體中沒(méi)有普遍存在的标志性基因（如細菌中的16S rRNA基因），因此設計針對(duì)整個噬菌體多樣性的引物很麻煩。PCR的另一個缺點是結果不可量化，因爲該反應具有終點特征。随著(zhe)該領域的進(jìn)步，開(kāi)發(fā)了定量PCR（qPCR）。類似地，蛋白質檢測領域也迅速發(fā)展，液相色譜-串聯質譜法（LC-MS-MS）可用于精确檢測和計數未知樣品中的多肽。
嵌入熒光染料的發(fā)現使人們能(néng)夠測量每個PCR循環後(hòu)聚合的DNA産物的量，即定量聚合酶鏈式反應（qPCR）方法。熒光由熱循環儀記錄，能(néng)夠一步擴增核酸并檢測熒光。計算初始DNA濃度時(shí)，可以將(jiāng)标準用作參考。整個qPCR平台中使用了兩(liǎng)種(zhǒng)基本化學(xué)成(chéng)分：第一種(zhǒng)是嵌入熒光DNA染料，第二種(zhǒng)是通過(guò)探針、附加的帶有熒光染料和猝滅劑分子的短DNA片段進(jìn)行操作。對(duì)于雙鏈DNA的定量，嵌入染料的使用選擇性比較低，使用熒光标記的探針更精确，因爲隻有在所有三個DNA片段（正向(xiàng)引物，反向(xiàng)引物和探針）成(chéng)功雜交并随後(hòu)聚合後(hòu)才能(néng)産生信号，這(zhè)兩(liǎng)種(zhǒng)方法已廣泛用于噬菌體生物學(xué)。
在液滴數字聚合酶鏈式反應（ddPCR）中，將(jiāng)樣品與疏水性物質混合形成(chéng)水油乳狀液，反應在每個液滴中同時(shí)進(jìn)行。將(jiāng)混合物通過(guò)熒光檢測器來計數在總液滴數量上發(fā)生放大的液滴數量。這(zhè)與樣品中模闆DNA的數量成(chéng)比例，因此無需外部标準就(jiù)可以用于計算初始濃度。
全基因組測序（WGS）不需要預先分離，即可通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)完整的噬菌體基因組進(jìn)行測序和組裝。Illumina測序技術通常用于識别新的噬菌體，還(hái)可以檢測來自不同栖息地的病毒，但是它們并沒(méi)有針對(duì)計數進(jìn)行優化。一些關于豐度的信息可能(néng)會(huì)被從組裝的重疊群的數量中提取出來，從而提供半定量數據。但是在重疊群組裝過(guò)程中數據的丢失，可能(néng)會(huì)導緻樣本中噬菌體的數量被低估。此外，細菌宿主DNA的攜帶、缺乏參考噬菌體基因組的數據庫以及噬菌體基因組的鑲嵌性質使得病毒全基因組測序作爲一種(zhǒng)計數和檢測方法具有一定的挑戰性，除非事(shì)先知道(dào)序列。
04   複雜樣品中噬菌體的定量
對(duì)複雜樣本（例如臨床樣本、糞便或食物）中的噬菌體進(jìn)行計數和檢測，由于可能(néng)影響結果的化學(xué)化合物的存在，需要進(jìn)行特殊處理。如果要從複雜樣品中定量單個噬菌體，必須先了解噬菌體及其宿主，以便對(duì)它們的動力學(xué)有一個完整的了解。相反，如果我們的目标是量化整個噬菌體種(zhǒng)群，那麼(me)我們的挑戰就(jiù)是去除抑制物。通常，起(qǐ)始的離心步驟會(huì)去除較大的顆粒，然後(hòu)使用聚四氟乙烯膜過(guò)濾器（孔徑爲0.22 mm-0.45 mm）過(guò)濾，濾液中會(huì)富含病毒顆粒。使用聚乙二醇濃縮濾液以獲得高濃度的病毒懸浮液，以進(jìn)行計數和檢測，如使用DLA。此外，基于PCR的方法，在病毒核酸分離之前應進(jìn)行物理分離，以最大程度地減少PCR抑制劑的殘留。使用全基因組測序對(duì)複雜樣品中的噬菌體進(jìn)行計數時(shí)，一個重要步驟是對(duì)讀數進(jìn)行過(guò)濾，以去除可能(néng)幹擾後(hòu)續分析的非病毒序列。總之，在處理複雜樣品時(shí)，選擇合适的預處理方法、下遊方法對(duì)獲得關于噬菌體濃度的綜合結果很重要。
近年來，随著(zhe)噬菌體在臨床上治療細菌感染、在食品中進(jìn)行生物控制的廣泛應用，使得對(duì)在複雜樣品中進(jìn)行噬菌體計數和檢測的方法的需求越來越大。最廣泛使用的選擇是DLA方法，因爲它在測定感染性噬菌體計數方面(miàn)具有快速、廉價和準确的優點。同時(shí)，幾種(zhǒng)分子生物學(xué)技術提高了速度和可重複性，但是這(zhè)些方法不能(néng)區分感染和缺陷的病毒顆粒，因此得出的結果很難與傳統的DLA空斑分析進(jìn)行比較。分子和噬菌體生物學(xué)的改進(jìn)可以將(jiāng)當前使用的計數和檢測方法的優點結合起(qǐ)來，而這(zhè)將(jiāng)有助于開(kāi)發(fā)新的計數和檢測方法。