抗菌新策略：基于噬菌體的靶标發(fā)現及其對(duì)新型抗菌分子的開(kāi)發(fā)

自1928年發(fā)現并在1940年代開(kāi)發(fā)用于臨床以來，抗生素已經(jīng)挽救了數百萬人的生命，并在無數重要的醫療程序中根深蒂固。然而，正是由于臨床上抗生素的過(guò)度使用，抗菌藥物耐藥性在全球範圍内日漸增長(cháng)，并且嚴重危及臨床治療效果。
目前抗生素開(kāi)發(fā)的局限性威脅到治療細菌感染的長(cháng)期能(néng)力。在過(guò)去的20年中，隻有少數幾類新的抗生素被發(fā)現并被批準用于臨床試驗。這(zhè)是由于中小型企業通常采用基于現有分子化學(xué)修飾的傳統研發(fā)策略進(jìn)行抗菌開(kāi)發(fā)。此外，目前抗生素的臨床研發(fā)管道(dào)主要集中在已知抗生素的組合上，因此隻有有限數量的抗菌靶标正在被開(kāi)發(fā)[1]。大多數抗生素對(duì)各種(zhǒng)細菌具有廣譜活性，如果使用不當不僅會(huì)加劇耐藥性的發(fā)展，還(hái)會(huì)對(duì)共生細菌如腸道(dào)微生物産生負面(miàn)影響。因此，迫切需要加速開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物，找到不易産生耐藥性并以更具體的方式發(fā)揮作用的新型抗菌靶點。
來自比利時(shí)基因技術實驗室的研究人員在current opinion in biotechnology期刊上發(fā)表了一篇題爲“Phage-based target discovery and its exploitation towards novel antibacterial molecules”的論文。在這(zhè)篇綜述中，作者提出了一種(zhǒng)綜合的噬菌體驅動策略，即通過(guò)噬菌體-細菌的相互作用來揭示新的抗菌靶點。這(zhè)種(zhǒng)策略將(jiāng)能(néng)夠設計出模拟抑制性噬菌體蛋白的小分子，并允許随後(hòu)開(kāi)發(fā)這(zhè)些抗菌化合物。不同于噬菌體療法和基于噬菌體酶的抗微生物劑，這(zhè)種(zhǒng)方法可能(néng)産生更可持續的新一代新抗生素，這(zhè)些抗生素利用新的細菌靶标并以病原體特異性方式起(qǐ)作用[2]。
噬菌體和細菌之間的相互作用是由它們緊密交織的共同進(jìn)化曆史驅動的。在整個進(jìn)化過(guò)程中，噬菌體在裂解感染周期中不斷适應以在軍備競賽中對(duì)抗它們的細菌宿主。噬菌體使用複雜的分子機制來劫持細菌細胞代謝以産生後(hòu)代病毒顆粒。這(zhè)種(zhǒng)密切的關系導緻了高度特異性和進(jìn)化優化的分子相互作用的出現，因此代表了識别新的潛在抗菌靶點的獨特來源。
随著(zhe)高通量基因組測序的進(jìn)步，研究者已經(jīng)對(duì)數以萬計的噬菌體基因組進(jìn)行了測序。噬菌體基因組大小從2.3kb到735kb不等，它們編碼精确的信息以改變宿主細菌中的DNA複制、RNA轉錄、細胞分裂和蛋白質翻譯途徑。然而，由于與已知蛋白質缺乏同源性以及實驗證據的滞後(hòu)，大約一半到三分之二的噬菌體基因産物僅被注釋爲功能(néng)未知的假設蛋白質。這(zhè)些假設蛋白質中的大多數在噬菌體感染的早期階段表達，表明它們在宿主代謝中具有重要作用。研究這(zhè)些噬菌體假設蛋白的功能(néng)，尤其是那些對(duì)宿主生長(cháng)有不利影響的蛋白質，不僅可以爲噬菌體生物學(xué)提供更詳細的見解，而且更重要的是或許還(hái)能(néng)增加對(duì)噬菌體感染過(guò)程中細菌重編程的了解[3,4]。
受噬菌體啓發(fā)的抗菌靶點發(fā)現
從噬菌體研究中揭示新的細菌靶點可以激發(fā)新型小分子化合物的篩選和設計，這(zhè)些化合物模拟了噬菌體蛋白的生長(cháng)抑制作用。2004年噬菌體衍生的抗菌靶點首次被發(fā)現。研究人員從26個金黃色葡萄球菌噬菌體的基因組中發(fā)現31個多肽家族對(duì)宿主表現出毒性[5]。其中一種(zhǒng)基因産物是來自金黃色葡萄球菌噬菌體77的ORF104，它與宿主DNA複制中的一種(zhǒng)必需蛋白質解旋酶裝載物 (DnaI) 相互作用。作爲一個新的靶點，DnaI和ORF104之間的相互作用随後(hòu)被用于時(shí)間分辨熒光(TR-FRET) 以篩選小分子抑制劑。最後(hòu)，在125000個經(jīng)過(guò)篩選的小分子中，有36個可以中斷DnaI和ORF104之間的分子相互作用，其中11個在合理的MIC (≤16 mg/ml)下對(duì)金黃色葡萄球菌具有直接活性。
盡管這(zhè)種(zhǒng)針對(duì)噬菌體蛋白及小分子盲篩的方法是從金黃色葡萄球菌中發(fā)現的，其原理啓發(fā)了其他研究者從噬菌體中尋找新的分子靶标。除革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌外，該篩查技術已應用于馬紅球菌、恥垢分枝杆菌以及包括大腸杆菌、銅綠假單胞菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌和肺炎克雷伯菌在内的一些革蘭氏陰性病原體。作者在本項研究中，想要擴展這(zhè)種(zhǒng)基于噬菌體的原始靶标發(fā)現策略，以更全面(miàn)的方式識别和利用新的抗菌靶标進(jìn)行藥物發(fā)現。該策略由兩(liǎng)種(zhǒng)互補方法驅動：一是“噬菌體基因組驅動篩選”，即從已知的有毒噬菌體蛋白開(kāi)始，引導發(fā)現靶點；二是 “細菌靶點驅動篩選”，即以識别針對(duì)已知假定細菌靶标的噬菌體編碼抑制劑。在确認這(zhè)些相互作用後(hòu)，這(zhè)些方法趨向(xiàng)于設計或篩選用于臨床前開(kāi)發(fā)的小模拟分子（圖1）。
噬菌體基因組驅動篩選
由于噬菌體基因組注釋中假設蛋白質非常豐富，因此在功能(néng)未知的“早期”假設蛋白質中尋找具有新靶點的殺菌多肽是合理的。從噬菌體基因組中篩選單個假設基因是一個耗時(shí)且費力的過(guò)程。因此，仔細選擇測試池可以減少工作量并最大限度地提高鑒定抗菌噬菌體蛋白的效率。除了消除編碼已知功能(néng)的蛋白質（包括結構蛋白）和具有預測跨膜結構域的蛋白質的基因外，關注小基因和早期基因顯著(zhe)降低了噬菌體基因篩選的工作量。事(shì)實上，大多數報道(dào)的噬菌體-宿主相互作用發(fā)生在感染的早期階段，并且涉及小的噬菌體蛋白（250個氨基酸）。或者，可以使用具有随機噬菌體基因組片段而不是單個基因的文庫，從而跳過(guò)單個基因克隆的繁瑣步驟。
爲了檢測假設的噬菌體蛋白引起(qǐ)的生長(cháng)抑制，需要使用高通量方法來縮短篩選過(guò)程，因此作者開(kāi)發(fā)了一種(zhǒng)基于高通量測序的篩選方法。在用LC-MS/MS消除噬菌體顆粒相關蛋白後(hòu)，所有“真實”假設的噬菌體基因片段都(dōu)連接到高拷貝載體pU11L4上，使用 Illumina HiSeq進(jìn)行轉化和測序。由于“有毒”基因産物不會(huì)爲細胞産生可行的重組質粒，因此基于這(zhè)些有毒基因座的測序深度降低的負選擇是可能(néng)的。實際上，可以從這(zhè)些區域以低序列覆蓋深度精确定位殺菌多肽（圖2）。此外，由于窄譜靶标將(jiāng)是未來抗菌治療的首選，所以應在多個宿主中測試已鑒定的抗菌噬菌體蛋白，以确定細菌靶标的毒性和保護範圍。
一旦鑒定出抗菌噬菌體蛋白，它們就(jiù)可以作爲發(fā)現抗菌靶标的誘餌。這(zhè)種(zhǒng)細菌相互作用夥伴的識别仍然是一個關鍵問題。爲此，可以使用不同的技術，包括質譜分析、酵母雙雜交和基于基因組的篩選，重點是通過(guò)删除或過(guò)表達目标蛋白來消除毒性。迄今爲止，最有希望的候選蛋白質包括那些影響宿主複制、轉錄和細胞分裂的蛋白質。
細菌靶向(xiàng)驅動篩選以鑒定噬菌體編碼的抑制劑
與篩選過(guò)程從大規模基因組挖掘開(kāi)始的噬菌體基因組驅動篩選方法不同，靶向(xiàng)驅動篩選使用宿主細胞中定義的必需蛋白質複合物作爲誘餌，從噬菌體中剔除未知的相互作用夥伴。在Van den Bossche等人的早期研究中，選擇參與銅綠假單胞菌代謝的必需蛋白質複合物作爲誘餌，包括用于轉錄和基因組複制的RpoA、DnaN，用于轉錄調控的MvaT、Hfq，用于細胞分裂的FtsZ，用于脂肪酸生物合成(chéng)的AcpP和用于能(néng)量維持的GlcB[6]。含有這(zhè)些标記蛋白複合物的突變菌株被噬菌體感染後(hòu)進(jìn)行質譜分析，在該分析中确定了37個噬菌體相互作用夥伴，其中8個直接影響細菌生長(cháng)。其他研究人員也使用類似方法從銅綠假單胞菌噬菌體中鑒定出一些與宿主生長(cháng)、代謝相關的重要蛋白質。
模仿噬菌體蛋白的生長(cháng)抑制作用 
被噬菌體多肽選擇性抑制的細菌蛋白可能(néng)成(chéng)爲新的抗菌靶點，因爲它們一旦被破壞後(hòu)可能(néng)會(huì)影響一些基本過(guò)程并導緻細菌生長(cháng)遲緩。通過(guò)對(duì)抗菌機制的進(jìn)一步表征以及相互作用位點的規範，以建立一種(zhǒng)有效的方法來識别模拟噬菌體蛋白抗菌作用的小分子或抗菌肽。此外，實驗方法應與結構和生物物理分析以及相互作用建模相結合，以能(néng)夠直接設計針對(duì)已識别靶标的有效抑制劑。
研究人員使用高分辨率X射線晶體學(xué)、核磁共振和低溫電子顯微鏡已經(jīng)确定了少數靶向(xiàng)假定抗菌靶标的噬菌體蛋白的結構。例如，通過(guò)冷凍電鏡對(duì)來自大腸杆菌噬菌體1的Gam和來自T7的Orc/Gp0.3的兩(liǎng)種(zhǒng)不同蛋白質進(jìn)行結構表征。結果發(fā)現兩(liǎng)者都(dōu)模仿DNA，并可能(néng)被用于開(kāi)發(fā)DNA結合蛋白抑制劑[7]。同樣，通過(guò)X射線晶體學(xué)發(fā)現噬菌體phiKZ的Dip蛋白與RNA結合位點結合，這(zhè)可能(néng)會(huì)激發(fā)RNA轉運抑制劑的發(fā)現。使用核磁共振發(fā)現來自大腸杆菌噬菌體T7的Gp2蛋白被證明可以改變RNA聚合酶的構象，從而限制ssDNA進(jìn)入活性位點，這(zhè)種(zhǒng)失活代表了另一種(zhǒng)使細菌RNA聚合酶失活的機制[8]。除了設計适合活性位點口袋的小分子外，計算機模拟方法還(hái)能(néng)夠優化化合物，提高它們的活性并計算它們的物理化學(xué)性質，從而增加成(chéng)功通過(guò)後(hòu)續臨床前階段的機會(huì)。
結論與展望  
作爲細菌病原體的“捕食者”，毒性噬菌體在對(duì)抗抗生素耐藥性發(fā)展的鬥争中展現出巨大的潛力。大多數噬菌體隻能(néng)感染一個物種(zhǒng)内非常有限的細菌分離株，這(zhè)種(zhǒng)特異性源于長(cháng)期的細菌-噬菌體進(jìn)化。除了將(jiāng)噬菌體顆粒應用于感染部位的噬菌體療法或溶素等基于酶的抗菌劑外，深入了解噬菌體劫持機制可以通過(guò)新的作用方式或設計新藥發(fā)現現有抗菌藥物的許多新靶點。值得注意的是，由于必須有特定的遺傳工具以及跨學(xué)科技術較難整合等問題存在，所以這(zhè)一研究領域在向(xiàng)其他新興病原體擴展時(shí)仍面(miàn)臨挑戰。然而，考慮到這(zhè)些進(jìn)化優化相互作用的高價值，與當前小分子篩選的随機性相比，這(zhè)條擴展的研發(fā)管線可能(néng)值得實施。
最近出現的利用噬菌體的策略已經(jīng)超越了它們最初的抗菌特性，轉向(xiàng)了其他替代方法。除了直接殺死宿主外，還(hái)可以在噬菌體研究中探索抗毒劑。用這(zhè)些化合物進(jìn)行預處理可能(néng)會(huì)降低病原體的毒力，使這(zhè)些細菌更容易被吞噬細胞吞噬和血清殺傷。由此，人體免疫系統成(chéng)爲噬菌體和細菌戰場上必不可少的第三方。這(zhè)個關鍵三角形成(chéng)爲開(kāi)發(fā)可持續抗菌藥物和了解人類與微生物組之間生物和進(jìn)化動态平衡的關鍵。  
參考文獻
1.Tyers, M. and G.D. Wright, Drug combinations: a strategy to extend the life of antibiotics in the 21st century. Nat Rev Microbiol, 2019. 17(3): p. 141-155.
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3.Al-Shayeb, B., et al., Clades of huge phages from across Earth's ecosystems. Nature, 2020. 578(7795): p. 425-431.
4.Li, T., et al., Isolation and Characterization of the Novel Phage JD032 and Global Transcriptomic Response during JD032 Infection of Clostridioides difficile Ribotype 078. mSystems, 2020. 5(3).
5.Yu, X., et al., Characterization and genomic study of "phiKMV-Like" phage PAXYB1 infecting Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 13068.
6.Van den Bossche, A., et al., Systematic identification of hypothetical bacteriophage proteins targeting key protein complexes of Pseudomonas aeruginosa. J Proteome Res, 2014. 13(10): p. 4446-56.
7.Wilkinson, M., et al., Structural basis for the inhibition of RecBCD by Gam and its synergistic antibacterial effect with quinolones. Elife, 2016. 5.
8.Sheppard, C., et al., A non-bacterial transcription factor inhibits bacterial transcription by a multipronged mechanism. RNA Biol, 2013. 10(4): p. 495-501.