噬菌體——腸道(dào)世界的新熱點

1.前言：

腸道(dào)，既是動物消化吸收的重要場所，也是重要的免疫器官。腸道(dào)對(duì)維持機體整體健康發(fā)揮著(zhe)極其重要的作用，其内栖息著(zhe)數量龐大的微生物，并且這(zhè)些微生物是維持腸道(dào)健康必不可少的因素。腸道(dào)微生态是指宿主腸道(dào)内的微生物與宿主相互作用，共同構成(chéng)一個生态系統，其核心是腸道(dào)菌群。因此，早期對(duì)腸道(dào)微生态的研究多集中在腸道(dào)菌群的結構和動态變化，而往往忽略了腸道(dào)病毒組的存在。但近年來腸道(dào)病毒組功能(néng)研究日益受到關注，其中腸道(dào)噬菌體作爲腸道(dào)病毒組的主要成(chéng)員，更是成(chéng)爲了明星熱點。

2.什麼(me)是腸道(dào)噬菌體：
在動物體内，微生物群落最密集的部位是腸道(dào)。腸道(dào)微生物包括細菌、古菌、原蟲、真菌以及病毒，研究表明，每克人的糞樣約有10^9～10^10個病毒樣顆粒(virus-like particle,VLP)，其中噬菌體是腸道(dào)病毒組的主要組成(chéng)。
2.1腸道(dào)噬菌體的分類

噬菌體是一類能(néng)感染細菌的病毒，既有具有殺死和清除細菌的能(néng)力的烈性噬菌體，也有存在于細菌裡(lǐ)并和宿主形成(chéng)共生關系的溫和噬菌體。烈性噬菌體感染其宿主菌後(hòu)，裂解細菌且釋放子代噬菌體，因此能(néng)夠直接影響動物腸道(dào)内多種(zhǒng)細菌的豐度、多樣性以及代謝。溫和噬菌體并不裂解細菌，而是將(jiāng)其基因組整合到宿主細菌基因組中，并随宿主的複制而複制，其中整合至細菌基因組的噬菌體稱爲前噬菌體（即其本質是核酸）。當腸道(dào)環境發(fā)生改變時(shí)，前噬菌體才進(jìn)入溶菌周期，裂解細菌。前噬菌體也是抗生素抗性基因與細菌毒力因子的一個重要來源，并能(néng)編碼有利于宿主菌生存的相關基因。
噬菌體也可按遺傳物質區分，其中雙鏈DNA噬菌體(主要有尾病毒目的肌尾病毒科、長(cháng)尾病毒科與短尾病毒科)與單鏈DNA噬菌體(主要是微小噬菌體科)是腸道(dào)内豐度最高，通過(guò)透射電子顯微鏡，人們發(fā)現人類糞便中噬菌體主要爲有尾噬菌體目。RNA噬菌體含量較少，且大部分RNA噬菌體來源于食物中的植物病毒。DNA噬菌體中有尾噬菌體目噬菌體與微小噬菌體科噬菌體的數量往往呈負相關，且有尾噬菌體目噬菌體與微小噬菌體科噬菌體的比例與機體健康密切相關——在腸道(dào)炎症性疾病(inflammatory bowel disease，IBD)患者及高脂高糖日糧誘導的肥胖小鼠腸道(dào)内，有尾噬菌體目噬菌體數量高，而微小噬菌體科噬菌體數量低。
2.2腸道(dào)噬菌體的研究方法
上世紀初，噬菌體被從細菌疾病中得到治愈後(hòu)病人的糞便中獲得，有人認爲噬菌體可能(néng)與腸道(dào)對(duì)抗有害細菌有關，且其抗菌效果可能(néng)比機體的免疫系統更有效。研究腸道(dào)噬菌體的傳統方法是通過(guò)顯微鏡觀察和體外培養。然而噬菌體擴增嚴格依賴宿主菌，而大多數菌在實驗室中又難以純化培養，因此通過(guò)體外培養能(néng)得到的信息十分有限。
後(hòu)來通過(guò)宏基因組測序，Qin等從124個糞便标本中發(fā)現，分理出的3.3百萬個非冗餘微生物基因，共計5767億個堿基對(duì)的序列，其中約5％爲編碼噬菌體的相關蛋白，這(zhè)意味噬菌體在腸道(dào)平衡中十分重要。但噬菌體少有通用标記基因，且噬菌體基因組偏小，平均在30kb左右，因此獲得完整噬菌體基因組數據仍舊困難。目前已知腸道(dào)病毒組數據中噬菌體基因序列較少，且大量噬菌體基因功能(néng)尚不清楚。
2.3腸道(dào)噬菌體的分布
腸道(dào)噬菌體的分布是反映噬菌體與機體關系的一個重要特征。有研究發(fā)現，在豬以及人的回腸段，噬菌體數量要高于大腸及糞樣中的噬菌體數量，這(zhè)意味著(zhe)不同腸段中噬菌體-細菌動态關系并不完全相同。Kim等發(fā)現，小鼠腸腔與黏膜層具有一些共有的噬菌體及各自特有的噬菌體，這(zhè)種(zhǒng)差異與腸腔、黏膜細菌組成(chéng)差異有關。目前對(duì)于腸道(dào)噬菌體分布情況仍需要進(jìn)行更多、更深入的研究，從而确定同一腸段不同部位及不同腸段中的噬菌體在組成(chéng)及功能(néng)上的差異。
3.腸道(dào)中噬菌體對(duì)菌群的影響：
3.1動物成(chéng)年前腸道(dào)内
“predator-prey dynamics”動态關系
動物自嬰兒時(shí)期起(qǐ)，腸道(dào)細菌與噬菌體的水平就(jiù)波動劇烈，直到成(chéng)年階段才趨于穩定。研究發(fā)現，動物成(chéng)長(cháng)至成(chéng)年前，腸道(dào)細菌多樣性增加，而噬菌體豐度降低。新生兒腸道(dào)噬菌體主要來自于食物及周圍環境，或從新定植的腸道(dào)細菌内的前噬菌體誘導而來。幼年時(shí)期，菌群與噬菌體存在“predator—prey dynamics”動态關系：一些細菌豐度升高後(hòu)，對(duì)應的烈性噬菌體豐度升高，導緻細菌豐度降低，爲有競争關系的細菌提供生長(cháng)空間，那些競争細菌豐度升高後(hòu)，其對(duì)應烈性噬菌體豐度升高，競争細菌豐度降低，如此循環。在早期機體建立腸道(dào)菌群的階段，烈性噬菌體與菌群形成(chéng)的“predator-prey dynamics”動态，使後(hòu)來細菌具有發(fā)展的空間，這(zhè)對(duì)維持腸道(dào)中細菌的多樣性有重要意義。
3.2動物成(chéng)年後(hòu)腸道(dào)内細菌與噬菌體動态平衡
健康成(chéng)人腸道(dào)内，細菌與噬菌體處于較穩定的動态平衡，受感染細菌通過(guò)不斷進(jìn)化以逃避噬菌體感染(如已被廣泛應用于基因編輯的CRISPR—Cas系統)，很多情況下細菌一旦獲得噬菌體抗性，通常會(huì)缺失具有細菌性緻病力的細胞表面(miàn)特征。反過(guò)來噬菌體也不斷進(jìn)化出新的感染策略(如通過(guò)合成(chéng)抗CRISPR蛋白幹擾CRISPR—Cas系統)。
腸道(dào)中溫和噬菌體占主導地位，其能(néng)賦予宿主菌抗雙重感染的能(néng)力，即在細菌之間能(néng)轉導抗生素抗性基因與細菌毒力因子，并且能(néng)編碼糖代謝、維生素和輔酶因子相關的基因，這(zhè)些因素爲宿主菌提供了生存優勢。由此可知，噬菌體與細菌的動态關系影響著(zhe)動物宿主的營養代謝與機體健康。同時(shí)，動物宿主的腸道(dào)環境及代謝發(fā)生改變能(néng)夠誘導溫和噬菌體進(jìn)入溶菌周期，影響噬菌體與菌群的動态關系。
4.腸道(dào)噬菌體在病理生理學(xué)方面(miàn)的研究及應用：
4.1腸道(dào)噬菌體在免疫功能(néng)方面(miàn)的研究
目前，關于噬菌體在腸道(dào)微生态中的生理或病理過(guò)程已經(jīng)有一定的研究基礎。Babickova和 Gardlik認爲，通常情況下腸腔中的噬菌體與菌群之間，不但在數量上維持著(zhe)平衡，起(qǐ)著(zhe)傳遞某些适應環境及排斥其他病原菌的利己基因。而且，噬菌體還(hái)能(néng)直接作用于胃腸黏膜層上的糖蛋白，起(qǐ)到抵禦病原菌入侵的作用。噬菌體還(hái)在部分健康人中的循環系統中被檢測到，因爲它們穿過(guò)腸道(dào)上皮屏障：當腸道(dào)發(fā)生炎症時(shí)，黏膜層上噬菌體大量增加。這(zhè)些噬菌體的産生與宿主菌死亡有關，這(zhè)導緻部分利己基因可能(néng)傳遞到病原菌中，同時(shí)因爲黏膜層的缺失，噬菌體對(duì)黏膜糖蛋白的作用就(jiù)會(huì)減弱，導緻噬菌體顆粒進(jìn)入到黏膜固有層甚至是血液循環系統中。在黏膜固有層中，噬菌體可能(néng)會(huì)引起(qǐ)局部的免疫反應。而噬菌體在進(jìn)入循環系統後(hòu)，就(jiù)可能(néng)會(huì)引起(qǐ)系統性的免疫反應。
此外，噬菌體病毒顆粒被發(fā)現可減少活性氧物質産生，以抑制T細胞和轉錄因子的激活促進(jìn)耐受，并發(fā)揮抗腫瘤活性，有研究表明在腸道(dào)中注射噬菌體，能(néng)引起(qǐ)免疫抑制且同時(shí)抑制體液免疫和細胞免疫。
4.2噬菌體療法
利用烈性噬菌體控制細菌性感染的方法被稱爲噬菌體療法。其基本過(guò)程一般包括：高效感染宿主菌、潛伏生長(cháng)、爆發(fā)期。烈性噬菌體感染宿主細菌後(hòu)，可釋放出子代噬菌體，感染和裂解其他宿主菌。早期的噬菌體療法在傷口和皮膚感染、呼 吸道(dào)、消化道(dào)、泌尿生殖道(dào)感染中均有應用，其給藥途徑取決于給藥目的和噬菌體性質，通過(guò)靜脈和胃腸道(dào)用藥是最常規的使用方法，除此之外還(hái)能(néng)經(jīng)皮給藥、霧化吸人、膀胱沖洗等。自上世紀以來，随著(zhe)抗生素的廣泛應用，噬菌體療法被忽視。但近年來抗生素耐藥菌的頻繁産生，大量抗生素方法失效，噬菌體療法重新得到關注。
但噬菌體療法并不成(chéng)熟：1) 噬菌體本身宿主譜狹窄，新的噬菌體需要不停發(fā)現、分離，且噬菌體對(duì)pH敏感。溫度、濕度、最小有效濃度的定量也待研究；2)免疫反應可直接或間接抑制噬菌體作用，宿主體内的巨噬細胞和抗體直接摧毀噬菌體；而且帶病菌本身也刺激著(zhe)宿主，宿主對(duì)細菌的免疫會(huì)間接抑制噬菌體療法的效果。此外，一些烈性噬菌體對(duì)體内菌群破壞速度過(guò)快，有可能(néng)導緻内毒素和超級抗原的産生；3)細菌對(duì)噬菌體存在抗性：單一培養的菌株可在數小時(shí)或數天内發(fā)展成(chéng)對(duì)噬菌體抵抗，且細菌在體外比在體内能(néng)更易形成(chéng)對(duì)噬菌體的抗性；4)噬菌體治療不是一種(zhǒng)的被普及被廣泛認可的現代醫學(xué)方法，權威機構對(duì)此缺少監管，大衆對(duì)噬菌體療法也缺乏正确認識，持畏懼、質疑态度；5）噬菌體因其活性和不穩定性，在穩定性、可靠性、安全性及成(chéng)本、生産、運輸、使用各方面(miàn)都(dōu)無法比拟抗生素。
4.展望：
噬菌體已經(jīng)是腸道(dào)研究中的熱點。研究表明，早期進(jìn)行外界幹預能(néng)夠長(cháng)期影響動物腸道(dào)菌群，因此，我們可能(néng)可以通過(guò)烈性噬菌體早期幹預動物腸道(dào)微生物群落，促進(jìn)機體形成(chéng)健康的菌群組成(chéng)。而且随著(zhe)近年來一些抗生素方法的失效，噬菌體作爲醫療手段大有可爲，尤其是針對(duì)慢性感染。但，相關噬菌體方法在各方面(miàn)還(hái)不完善。
無菌動物作爲腸道(dào)微生物研究中的明星模型，如今發(fā)揮著(zhe)舉足輕重的作用。能(néng)否在無菌動物上找到噬菌體研究方向(xiàng)，加深無菌動物的應用領域，是我們這(zhè)些研究者值得思索的。