飼料全面(miàn)禁抗：噬菌體療法能(néng)開(kāi)創替抗新局面(miàn)嗎？

編者按：
抗生素的過(guò)度使用導緻動物源細菌耐藥性形勢嚴峻，嚴重影響了食品安全和公共衛生安全。2020 年，中國(guó)農業農村部發(fā)布了相關的規定，全面(miàn)實行飼料禁抗措施。那麼(me)，在禁抗的大背景下，我們應該如何應對(duì)細菌感染呢？如何保護牲畜呢？有什麼(me)新的方法呢？
今天，我們共同關注噬菌體療法在農業上的應用。希望本文能(néng)夠爲相關的産業人士和諸位讀者帶來一些啓發(fā)和幫助。
① 有力武器：噬菌體
2013 年，Tobi Nagel 結束了在格魯吉亞長(cháng)達十年的探索之旅。在格魯吉亞的藥房裡(lǐ)，除了傳統的抗生素之外，消費者們還(hái)有另外一種(zhǒng)選擇——噬菌體溶液。噬菌體是一種(zhǒng)微型病毒，可以通過(guò)滲透作用，從内部溶解破壞細菌結構。
當時(shí)，Nagel 還(hái)在對(duì)低收入國(guó)家進(jìn)行考察——這(zhè)是她作爲制藥行業藥物開(kāi)發(fā)科學(xué)家的工作之一，她一直在尋找成(chéng)本效益最高的藥物生産方法。
Nagel 表示：“生活在兩(liǎng)個不同的世界，總是讓人感覺不安。在美國(guó)開(kāi)發(fā)一種(zhǒng)新的藥物可能(néng)需要花費 10 億美元，而那些發(fā)展中國(guó)家的人可能(néng)永遠無法接觸到這(zhè)些藥物。因此，當我了解到噬菌體的作用機制後(hòu)，我立刻意識到，這(zhè)就(jiù)是我一直在尋找的技術，一種(zhǒng)物美價廉的技術。”
病毒被認爲是地球上分布最廣泛的生物體，自第二次世界大戰以來，病毒就(jiù)被東歐國(guó)家廣泛用作治療細菌感染。對(duì) Nagel 來說(shuō)，更重要的是，它們是普通抗生素的廉價替代品。
因此，自 2014 年開(kāi)始，Nagel 就(jiù)開(kāi)始著(zhe)手發(fā)起(qǐ)全球衛生噬菌體（Phages for Global Health，PGH）項目，一個旨在將(jiāng)噬菌體及相關技術傳播到非洲和亞洲的非營利性組織。
PGH 和一些初創企業看到了噬菌體進(jìn)入畜牧業和食品生産領域的大好(hǎo)應用前景，因爲在上述行業中，噬菌體相對(duì)容易獲批，且生産成(chéng)本較低。相對(duì)于抗生素來說(shuō)，噬菌體具有絕對(duì)的價格競争優勢，并且可以幫助農民快速抗擊細菌。
這(zhè)些病毒可以降低世界各地農民對(duì)小分子抗菌素的依賴，并爲人類提供一種(zhǒng)對(duì)抗抗生素耐藥性的有力武器。化學(xué)家和研發(fā)工程師正在抓緊改進(jìn)配方，試圖研制出成(chéng)型的噬菌體産品，并進(jìn)一步延長(cháng)噬菌體的保質期。除此之外，還(hái)需要想辦法去說(shuō)服那些已經(jīng)習慣了使用傳統抗生素的農民改用新技術。
圖.全國(guó)衛生噬菌體組織（PGH）機構人員正在對(duì)當地研究人員進(jìn)行現場培訓，通過(guò)觀察噬菌體對(duì)該地區土壤、農場和水樣的反應，來篩選出有效的噬菌體。
② 必要的替代品
彎曲杆菌是一種(zhǒng)螺旋狀細菌，雖然隻有幾微米長(cháng)，但是廣泛分布于肯尼亞。彎曲杆菌與志賀氏菌和沙門氏菌同屬于食源性細菌，是引起(qǐ)肯尼亞腹瀉病的主要原因之一。據《全球疾病負擔》報告估計，2019 年，肯尼亞每 1000 名 5 歲以下兒童中，就(jiù)有1人死于腹瀉病。
彎曲杆菌的常見宿主是雞。如果在屠宰和出售過(guò)程中，食品沒(méi)有進(jìn)行冷藏保存，那麼(me)就(jiù)會(huì)成(chéng)爲細菌繁殖的天堂。此時(shí)，如果恰好(hǎo)有一個消費者，不幸地購買了這(zhè)些含有彎曲杆菌的肉類，并發(fā)生了感染，那麼(me)其能(néng)夠使用的有效抗生素種(zhǒng)類會(huì)很有限，因爲肯尼亞地區普遍分布著(zhe)該細菌的耐藥性菌株。
2016 年，對(duì)肯尼亞全國(guó)進(jìn)行的一項調查研究顯示，在 90%以上的雞及其糞便中發(fā)現了彎曲杆菌，且至少 61%培養樣本具有多重耐藥性。
造成(chéng)多重耐藥性的兇手之一是農民，他們頻繁使用抗生素來預防感染，甚至是去治療那些與微生物感染并不沾邊的疾病。而且，農民還(hái)大量使用藥物，來促進(jìn)牲畜的生長(cháng)，而不是通過(guò)增強能(néng)量，來避免感染。動物可以利用能(néng)量促進(jìn)骨骼和肌肉的生長(cháng)。
烏幹達 Makerere 大學(xué)微生物學(xué)家和噬菌體捕獵者 Jesca Nakavuma 表示：“當一個農民眼中隻有動物的經(jīng)濟價值時(shí)，他們就(jiù)會(huì)不惜一切代價保證動物活著(zhe)。”全世界範圍内，都(dōu)存在著(zhe)抗生素過(guò)度使用的現象，以至于歐盟和美國(guó)已經(jīng)明令禁止農民使用抗生素，來預防疾病和促進(jìn)動物生長(cháng)。
但是抗生素是一把鈍器，會(huì)無差别地根除各種(zhǒng)有害和有益的細菌。從長(cháng)期來看，過(guò)度使用抗生素會(huì)導緻細菌耐藥性更強，以至于更難利用現有藥物殺死細菌。這(zhè)就(jiù)是爲什麼(me) Nakavuma 會(huì)聯合 PGH，識别具有有益作用的噬菌體，以幫助農民和醫生將(jiāng)噬菌體治療作爲抗生素治療的補充療法。
與抗生素相比，噬菌體更像是一把手術刀。通常噬菌體會(huì)寄生在特定的細菌内，對(duì)其表面(miàn)進(jìn)行攻擊，而不影響其他種(zhǒng)類細菌的繁衍。
根據噬菌體研究人員的說(shuō)法，在農業中過(guò)度使用噬菌體應該不會(huì)有什麼(me)太大的問題。因爲從理論上講，噬菌體具有“自醫”和“自限”性：農民需要提供足夠多的病毒，才能(néng)使病毒到達動物小腸内的特定細菌體内。一旦到達細菌體内，噬菌體會(huì)在細菌體内進(jìn)行自我複制和繁衍，最終使細菌破裂、死亡。然後(hòu)新的噬菌體就(jiù)會(huì)被釋放出來，尋找新的寄主。
盡管噬菌體和抗生素都(dōu)能(néng)殺死細菌，但細菌對(duì)二者産生耐藥性的方式卻不盡相同。
抗生素耐藥性産生的方式往往是以下兩(liǎng)種(zhǒng)：細菌通過(guò)蛋白將(jiāng)抗生素泵出細胞，或者分泌一種(zhǒng)可以將(jiāng)抗生素分子分解掉的酶。當存活的細菌逐漸聚集并“分享”用于消除抗生素的 DNA 時(shí)，耐藥性就(jiù)會(huì)逐漸增強。
而噬菌體是不斷變化的。它們的變異速度非常快，與細菌變異速度一緻，以至于細菌無法通過(guò)分享抵禦機制，來消除噬菌體的威脅。
然而，一些針對(duì)噬菌體的抵禦機制可以提供更持久的抵抗力。例如，某些細菌可以將(jiāng)噬菌體 DNA 片段保存在基因組中，以便以後(hòu)能(néng)夠根據這(zhè)些關鍵特征進(jìn)行病毒識别和攻擊。
但由于這(zhè)些 DNA 信息記錄的形成(chéng)需要一定的時(shí)間，在細菌之間共享抵禦機制之前，病毒可能(néng)就(jiù)已經(jīng)發(fā)生了進(jìn)化。最重要的是，這(zhè)種(zhǒng)信息記錄的容量并不是無限的，所以細菌爲了不斷地獲取新的序列，需要不斷去忘記過(guò)去記錄的序列。
耶魯大學(xué)生物學(xué)家、Felix 生物技術公司噬菌體治療法聯合創始人 Paul Turner 表示：“細菌無法進(jìn)化出噬菌體抗性，并將(jiāng)這(zhè)種(zhǒng)機制分享給其他細菌。這(zhè)根本不會(huì)發(fā)生。”
圖.烏幹達地區由于缺乏冷藏設備，可能(néng)導緻肉類制品上細菌滋生。這(zhè)些屠夫的目标，是在屠宰後(hòu) 24 小時(shí)内盡快售出他們的産品。
③ 穩定的噬菌體
新型抗生素并不會(huì)憑空出現，需要數億美元去發(fā)現、調整、完善，并最終在符合規範的設施中制造出來。但是，有細菌的地方就(jiù)會(huì)有噬菌體：土壤、水以及動物體内。這(zhè)就(jiù)是噬菌體研究人員尋找候選藥物的地方。
爲了研制出最有效的噬菌體治療方法，專家們試圖從當地環境——細菌滋生的地方如污水、農家肥和溪流中采集病毒。
Nakavuma 希望通過(guò)收集這(zhè)些野生病毒，來構建一個地域性噬菌體庫。
特定類型的噬菌體已經(jīng)進(jìn)化到可以針對(duì)性殺死它們在野外遇到的細菌的某一個亞類。一旦生物學(xué)家弄清楚培養物中與目标細菌一起(qǐ)生長(cháng)的病毒有哪些，他們就(jiù)會(huì)對(duì)該病毒的基因組進(jìn)行測序，并將(jiāng)其添加到數據庫中進(jìn)行保存。
之後(hòu)，當一個地區牲畜出現病原體性疾病時(shí)，專業技術和基礎設施將(jiāng)可以立馬提供量身定制的噬菌體雞尾酒，就(jiù)好(hǎo)像我們每年通過(guò)調整流感疫苗，來預防正在流行的病毒株。
但是一旦離開(kāi)它們的栖息地，噬菌體就(jiù)會(huì)變得有點挑剔。抗生素仍然在農場占據主導地位的一個重要原因是它們便宜且穩定。噬菌體可能(néng)相對(duì)更脆弱一些——如果無法以細菌爲食，它們在室溫下會(huì)變得不活躍。對(duì)于農民來說(shuō)，這(zhè)是一個問題。因爲他們沒(méi)有足夠多、足夠大的冰箱，可以在 4℃ 溫度下，保存大量的噬菌體溶液。
因此，研究人員正在尋找一種(zhǒng)可以將(jiāng)這(zhè)些溶液烘幹，使噬菌體可以以一種(zhǒng)不需冷藏的固态狀态儲存。PGH 聯合工程師，設計出了實現這(zhè)一目标的方法。Alberta 大學(xué)的 Reinhard Vehring 聯合 PGH，對(duì)噴霧幹燥工藝進(jìn)行了優化，用于制備封存有抗彎曲杆菌噬菌體的粉末。
噴霧幹燥是指利用一種(zhǒng)加熱的氣體將(jiāng)液體噴霧爲氣溶膠，并快速進(jìn)行幹燥的方法，該方法可以在一小時(shí)内生産出成(chéng)噸粉末。這(zhè)也是大規模生産奶粉的常用方法。但是噬菌體與牛奶不同，它們需要保持完整的蛋白質複合物，一旦蛋白結構被破壞，病毒遇水後(hòu)也無法再進(jìn)行自我複制。
爲了保證粉末狀噬菌體的安全，Vehring 的實驗室借鑒了複活植物鱗葉卷柏（Selaginella lepidophylla）的策略。卷柏可以在沒(méi)有水的情況下生存數年。幹旱時(shí)，卷柏會(huì)用糖分子替代其維持細胞器結構的氫鍵水分子，形成(chéng)所謂的糖玻璃。當下雨時(shí)，水分會(huì)重新充滿細胞時(shí)，此時(shí)，卷柏就(jiù)會(huì)重獲生機。
爲了模拟上述過(guò)程，研究人員在進(jìn)行噴霧幹燥前，將(jiāng)海藻糖添加到噬菌體懸浮液中。Vehring 說(shuō)，一種(zhǒng)理論認爲，海藻糖分子有助于包裹和穩定噬菌體。利用海藻糖處理過(guò)的病毒，可以在室溫下保存，且貨架期可達數月甚至一年。而且隻要再次加水，噬菌體就(jiù)會(huì)複活，攻擊彎曲杆菌。
其他研究人員正試圖用另一種(zhǒng)方式封裝噬菌體。Nicholas Svitek 擔任國(guó)際牲畜研究所（ILRI）的高級科學(xué)家，目前在肯尼亞工作，專門從事(shì)沙門氏菌相關研究。
國(guó)際牲畜研究所采取的舉措之一就(jiù)是發(fā)展和促進(jìn)可持續和可規模化的牲畜業實踐，以限制抗生素耐藥性的産生。Svitek 表示，該機構的研究小組正在探索封裝噬菌體的方法，即將(jiāng)病毒聚集在多糖或二氧化矽的微米或納米顆粒上。
海藻酸鹽和堿性多糖殼聚糖混合而成(chéng)的封裝材料，不僅可以保護噬菌體在儲存期不受外界環境的影響，而且還(hái)可以保護噬菌體不受動物酸性胃液的影響。如果噬菌體需要穿過(guò)胃部找到腸道(dào)中生長(cháng)的細菌，這(zhè)一特性就(jiù)很重要了。當然，上述方案僅适用于作爲飼料添加劑或者添加到水中的幹燥粉劑和膠囊。
總部位于蘇格蘭的初創公司 Fixed Phage，正在試圖將(jiāng)噬菌體封裝到食物中。該公司目前正在對(duì)表面(miàn)沾有噬菌體的魚飼料顆粒進(jìn)行調整。
Fixed Phage 公司將(jiāng)經(jīng)過(guò)預處理的飼料視爲一種(zhǒng)便于農民使用的産品。該公司首席科學(xué)官 Jason Clark 表示：“就(jiù)适用性而言，這(zhè)總比我們將(jiāng)其保存在 4℃ 冰箱中要好(hǎo)得多——必須現取現用，适量使用，用完還(hái)需要立刻放回冰箱。”
爲了將(jiāng)噬菌體固定在食物顆粒上，Fixed Phage 借鑒了一種(zhǒng)可將(jiāng)墨水印在塑料上的通用方法。該公司在放電下運行這(zhè)些顆粒——噴射出的等離子體使表面(miàn)電離——并迅速向(xiàng)其噴灑噬菌體溶液。随著(zhe)溶液逐漸幹燥，病毒粘附在電離顆粒上，可在室溫下儲存數月而不失去活性。該公司正在對(duì)其飼料進(jìn)行現場實驗，以了解噬菌體在現實世界中是如何發(fā)揮作用的。
圖.2017 年，在烏幹達舉行的“全球衛生噬菌體研讨會(huì)”上，科學(xué)家們觀察了細菌培養物。
④ 重重挑戰
去年 10 月，Evans Agbemafle 帶著(zhe)面(miàn)罩，站在一群加納東部水産養殖戶面(miàn)前，向(xiàng)他們詳細說(shuō)明了噬菌體的好(hǎo)處，并試圖消除養殖戶們的擔憂。
Agbemafle 是加納政府科學(xué)工業研究委員會(huì)（CSIR）的科學(xué)家，也是 SafeFish 項目的共同負責人之一。該項目旨在解決烏幹達和加納蓬勃發(fā)展的水産養殖業所面(miàn)臨的魚類死亡問題。去年，在非洲聯盟和歐洲委員會(huì)提供的 100 萬美元資金資助下，SafeFish 科學(xué)家開(kāi)始著(zhe)手收集當地土壤、糞便、溪流和魚腸道(dào)内容物，以便最終能(néng)夠提純并表征該地區的噬菌體群。
研究人員傾向(xiàng)于使用當地的噬菌體，但是加納缺乏高精尖的基因測序設備和解讀基因數據的生物信息學(xué)家，這(zhè)也是加納發(fā)展主要的阻礙。
因此，Agbemafle 和 Makerere 大學(xué)的 Nakavuma 有意與其他機構合作，通過(guò)組裝設備和集合專業知識，對(duì)噬菌體進(jìn)行識别和歸類。
他們更遠大的目标是建立一個區域性噬菌體研究聯盟和數據庫，從而幫助非洲國(guó)家更好(hǎo)地應對(duì)耐藥性細菌的出現。但是這(zhè)還(hái)有很長(cháng)的路要走。Agbemafle 說(shuō)：“我們現在是從零開(kāi)始。”
技術問題可能(néng)比較複雜。PGH 的 Nagel 回憶說(shuō)，她曾于 2020 年初在坦桑尼亞主持過(guò)一次研讨會(huì)，期間她試圖向(xiàng)當地的生物化學(xué)家展示如何使用 Oxford Nanopore 技術公司的 MinION 手持式基因測序儀。雖然已經(jīng)爲該設備設置了專用路由器，但帶寬仍然無法滿足對(duì)樣本中的基因組進(jìn)行測序。最終，PGH 的科學(xué)家們使用了移動熱點來完成(chéng)培訓。
Nagel 說(shuō)：“所以就(jiù)是這(zhè)樣零碎的小事(shì)，停電、缺少制冷設備等。”
PGH、SafeFish 團隊及 ILRI 表示，與農民交流互動，對(duì)于農民最終接受采用新農産品至關重要。來自研讨會(huì)和焦點小組以及該地區工作人員的反饋，有助于指引研究人員的設計過(guò)程。
ILRI 博士後(hòu) Angela Makumi 說(shuō)：“當你了解了農場系統的生态機制後(hòu)，你就(jiù)能(néng)理解産品的發(fā)展方式，這(zhè)并不是全部都(dōu)适用的。”
Makumi 來自肯尼亞，在回國(guó)前曾在歐洲接受過(guò)噬菌體生物學(xué)家的培訓。回國(guó)後(hòu)，帶回了新的理論知識，可以幫助研究團隊确認農民對(duì)噬菌體産品的具體需求。例如，爲了降低成(chéng)本，他們傾向(xiàng)于不單獨購買産品，而是希望購買已經(jīng)添加了噬菌體的飼料或已經(jīng)混合了疫苗的飼料。
Nakavuma 表示：“如果我們在沒(méi)有事(shì)先讓農民知悉并産生興趣的情況下，引入一種(zhǒng)産品，那麼(me)讓農民采用該産品將(jiāng)是一項艱巨的任務。因此，我希望在我們研發(fā)出新産品時(shí)，已經(jīng)先赢得了他們的信任。”