噬菌體治療人和動物革蘭氏陰性菌感染的應用

前言 
耐藥革蘭氏陰性細菌在世界範圍内引起(qǐ)了高發(fā)病率和死亡率的院内感染，對(duì)人類生命健康造成(chéng)了日益嚴重的威脅。其中，最常見和最嚴重的是鮑曼不動杆菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、大腸杆菌和鼠傷寒沙門氏菌。WHO制定出了一份亟待研發(fā)抗菌劑的優先級病原體清單，其中，對(duì)碳青黴烯類抗生素耐藥的鮑曼不動杆菌、銅綠假單胞菌和腸杆菌(如肺炎克雷伯菌、大腸杆菌和腸杆菌屬)是極重要的優先級病原體，沙門氏菌是高度優先級病原體。這(zhè)些耐藥性細菌感染持續威脅著(zhe)公共衛生安全，尋找新治療方法的需求與日俱增。
1.細菌發(fā)生耐藥性的原因和機制
随著(zhe)青黴素的發(fā)現，醫學(xué)界進(jìn)入了“抗生素的黃金時(shí)代”，大量的抗生素被應用于細菌感染的治療和控制，并取得了前所未有的功效。然而，正是抗生素的廣泛可得性及其成(chéng)功應用，導緻了細菌耐藥性的出現。此外，不适當的處方、農業上的廣泛使用、數量較少的新種(zhǒng)類抗生素也是導緻耐藥性發(fā)生的原因。這(zhè)些嚴峻的生存壓力誘導了細菌耐藥性基因發(fā)生獲得性突變，再加上頻繁的細菌自然突變和多種(zhǒng)形式的耐藥性基因轉移，使得細菌耐藥性問題日益嚴重。
從機制上看，細菌對(duì)抗生素固有耐藥的主要決定性因素是其獨特的細胞結構抑制了抗生素的通透性，其它機制還(hái)包括限制藥物的攝取、藥物靶點的修飾、藥物的失活和藥物的主動外排（圖1）。随著(zhe)抗生素耐藥性的迅速傳播，也許預示著(zhe)“後(hòu)抗生素時(shí)代”的到來，迫切需要新的抗生素替代治療方案。因此，噬菌體再次走入人們的視野，引起(qǐ)了廣泛關注。

圖1 細菌對(duì)抗生素的耐藥機制
2.噬菌體
噬菌體存在于自然界中且易于從環境中分離，用于治療的噬菌體的典型來源包括廢水、淡水和土壤樣品。噬菌體是專噬性的細菌病毒，能(néng)高特異性地感染宿主菌。噬菌體的生活周期可以分爲專性裂解和溶原複制周期（圖2），有些噬菌體可以在這(zhè)兩(liǎng)種(zhǒng)狀态之間來回轉換。一般來說(shuō)，將(jiāng)烈性噬菌體用于噬菌體治療，以達到清除病原菌的目的。由于單一噬菌體的高特異性，其宿主範圍一般較窄，而噬菌體“雞尾酒”不僅拓寬了宿主範圍，還(hái)減少了細菌對(duì)噬菌體的耐受性，在噬菌體治療上有更廣闊的應用前景。

圖2 噬菌體的生活周期
3.噬菌體治療在動物模型上的應用
噬菌體在不同動物模型中的應用已得到了廣泛的報道(dào)，模拟了可能(néng)發(fā)生在人類身上的感染。其中，小鼠和大鼠感染模型報道(dào)較多[2-4]，而兔、豬、羊或牛的感染模型使用較少。研究内容主要集中在評估噬菌體的治療效果，但也有很多研究關注了噬菌體的藥代動力學(xué)[5]、炎性反應[6]等科學(xué)問題。噬菌體作爲生命體能(néng)夠在體内自我複制，其在體内的代謝動力學(xué)與其它無生命藥物不同，可通過(guò)噬菌體數目變化與時(shí)間對(duì)應關系對(duì)噬菌體動力學(xué)進(jìn)行評估。

• 在肺炎治療上的應用

革蘭氏陰性細菌是世界範圍内醫院獲得性肺炎和慢性肺部感染的重要原因。在大多數情況下，鼻内給藥是肺部感染動物模型的首選噬菌體給藥途徑，這(zhè)一途徑确保了噬菌體能(néng)夠高濃度地到達肺部細菌，從而獲得更快的治療效果。另外也有一些模型采用了霧化吸入或腹腔内給藥的途徑，噬菌體使用量約是細菌載量的10倍。治療效果是由給藥劑量、給藥途徑和給藥時(shí)間決定的，存活率和細菌載量的變化都(dōu)是呈劑量依賴性的。所有噬菌體動力學(xué)的研究都(dōu)表明，在相同的時(shí)間點，無論是在肺組織中還(hái)是在血液中細菌感染組的噬菌體滴度均高于單純噬菌體組（圖3）。這(zhè)表明噬菌體在宿主細菌中發(fā)生了自我複制，導緻了感染動物體内噬菌體滴度升高。在組織病理學(xué)方面(miàn)，噬菌體治療可防止肺泡壁增厚和減少中性粒細胞浸潤。

圖3 在血液和組織中細菌感染對(duì)噬菌體動力學(xué)的影響

• 在菌血症治療上的應用

菌血症可導緻敗血症和敗血症休克，尤其是當患者免疫功能(néng)低下時(shí)。在這(zhè)類研究中，最常見的給藥途徑是腹腔注射或靜脈注射，而腹腔内注射是動物血流感染模型的首選噬菌體給藥途徑。噬菌體劑量以MOIs≥1爲佳。菌血症的治療效果呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性，生存率與噬菌體開(kāi)始治療時(shí)間呈負相關。免疫功能(néng)越強，其存活率越高。與其他器官或血液相比，噬菌體在脾髒和肝髒中存活的時(shí)間更長(cháng)。優化噬菌體幹預劑量、提高免疫水平、提早開(kāi)始治療時(shí)間可能(néng)是治療目标疾病的高效方法。

• 在外傷治療上的應用

革蘭氏陰性菌引起(qǐ)的外傷感染尤其需要緊急治療，因爲它們能(néng)夠引起(qǐ)進(jìn)行性組織損傷和菌血症。在這(zhè)些感染中可用敷料進(jìn)行噬菌體局部治療。傷口的減小或愈合和細菌數目的變化可作爲噬菌體治療效果的評價指标。在給藥過(guò)程中，脾髒是噬菌體存留時(shí)間最長(cháng)的器官，其次是肝髒。脂質體包埋可減少噬菌體的清除，使它們在脾髒、肝髒和其他組織中維持的時(shí)間更長(cháng)（圖4）。噬菌體治療後(hòu)可降低炎性反應和皮膚損傷程度，減少中性粒細胞浸潤。

圖4 脂質體包埋增強噬菌體抗菌活性的可能(néng)機制
4.噬菌體治療在人類臨床案例上的應用
從體外和動物模型的臨床前體内數據來看，噬菌體治療取得了較好(hǎo)的結果，在臨床環境中噬菌體同樣表現良好(hǎo)。可根據感染部位選擇合适的噬菌體給藥方式，如：傷口感染的治療可采用噬菌體局部給藥，尿路感染可通過(guò)經(jīng)尿道(dào)導尿管給藥，肺部感染可通過(guò)靜脈或霧化途徑。在已報道(dào)的噬菌體治療案例中，耐藥菌感染患者得以恢複，但少有對(duì)噬菌體動力學(xué)、組織學(xué)和免疫學(xué)方面(miàn)的研究。噬菌體的安全性評價由臨床評估、生化參數(包括肝腎功能(néng)和血液學(xué)參數)确定。大部分患者對(duì)噬菌體治療的耐受性良好(hǎo)，很少有不良事(shì)件報道(dào)。
5.噬菌體治療面(miàn)臨的挑戰
雖然動物模型研究和臨床病例報告表明噬菌體療法可以有效地治療細菌感染，但未來的道(dào)路仍面(miàn)臨多重挑戰。治療性噬菌體的商業開(kāi)發(fā)是一個持續的過(guò)程。噬菌體産品已可用于食品安全應用[7]、控制植物病原體、水産養殖，并作爲營養補充劑。這(zhè)些領域對(duì)最初的商業化更具吸引力，因爲這(zhè)些部門的營銷監管要求一般比藥品簡單得多。將(jiāng)噬菌體産品通過(guò)有關監管部門的申報、審批、生産和銷售還(hái)需要多方的共同努力。此外，用噬菌體治療革蘭氏陰性細菌感染可能(néng)導緻脂多糖的快速釋放，随後(hòu)導緻機體的炎症反應和血常規指标的異常，工程改造的噬菌體組成(chéng) “雞尾酒”可能(néng)將(jiāng)是更好(hǎo)的出路，而且爲最終産品提供了更強的知識産權保護，這(zhè)是商業藥物開(kāi)發(fā)的一個重要問題。
結論 
全球出現的多重耐藥革蘭氏陰性菌感染威脅著(zhe)公共衛生事(shì)業和人類健康，噬菌體療法爲應對(duì)這(zhè)一全球性挑戰提供了新的出路。根據感染類型、目标細菌的耐藥性水平以及現有抗生素的有效性，噬菌體治療的臨床試驗可以設計爲單一治療或聯合治療。動物模型系統可作爲開(kāi)發(fā)新的噬菌體療法的有力工具，也可用于指導設計臨床試驗并降低其風險。噬菌體治療應用于人類的病例目前僅限于少數，但這(zhè)些治療已經(jīng)證明噬菌體可以用于對(duì)抗危及生命的耐藥細菌感染。（文章來源：上海噬菌體與耐藥研究所）